紫外交聯(lián)儀用于PCR樣品制備過程中消除擴(kuò)增子
紫外波長(nm)一般選擇254nm,照射30min即可。需要注意的是,選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時,要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布,UV照射僅對500bp以上長片段有效,對短片段效果不大。UV照射時,PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體,這些二聚體可使延伸終止,但并不是DNA鏈中嘧啶均能形成二聚體,且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長,嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA鏈上,形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基,其他非二聚體的光照損傷(如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體,胸腺嘧啶乙二醇,DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等)均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。如果這些位點(diǎn)(0.13/堿基)在DNA分子上隨機(jī)分布,一個500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點(diǎn),那么,105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反,如果100bp的片段,每條鏈上僅有6處損傷,105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長度限制的原因。