近紅外熒光蛋白是綠色熒光蛋白同源的一類熒光蛋白，可利用自身特殊的結構催化形成生色團，且具備許多優(yōu)良的特點：
(1)易于檢測，靈敏度高，熒光性質穩(wěn)定。熒光蛋白生色團的成熟不需要添加底物或其他輔助因子，僅在激發(fā)光激發(fā)下就能發(fā)出熒光，單細胞標記清晰，熒光顯微鏡下很容易觀察到；
(2)熒光蛋白基因編碼序列短，易構建載體；
(3)細胞毒性小，可直接標記活細胞或活體組織；
(4)相比于 GFP，它的激發(fā)光和發(fā)射光波長更長，位于近紅光區(qū)(650~900 nm)，在動物組織中光吸收和光散射較低，有較高的穿透性[22]，更適宜于動物活體組織的深層成像，是活體成像更為理想的熒光標記分子。
本研究使用的近紅外熒光蛋白 iRFP682 的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為 663 nm 和 682 nm，是單體熒光蛋白分子，其發(fā)光性質較為穩(wěn)定，較長的光譜特點使其在活體動物組織成像的應用中更具潛力。

熒光蛋白作為標記分子在生命科學的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。熒光蛋白具備良好的性能，其在發(fā)揮標記分子的作用中相比于傳統(tǒng)的生物標記分子有諸多優(yōu)良特點，不需要額外的底物或輔助因子，僅在藍光或紫外激發(fā)下即可發(fā)出明亮的熒光，檢測方便且靈敏性高。熒光蛋白獨特的發(fā)光特性使其廣泛應用于動物、植物、微生物等的研究中，涉及分子水平、細胞水平，再到動物活體或全身成像等。

近紅外熒光蛋白（Near-infrared fluorescent protein，iRFP）是綠色熒光蛋白同源的一類熒光蛋白，具備綠色熒光蛋白的發(fā)光優(yōu)點。但是，相比于GFP，它的激發(fā)光和發(fā)射光波長更長，位于近紅光區(qū)（650~900nm），在動物組織中光吸收和光散射較低，有較高的穿透性，更適宜于動物活體組織的深層成像，是深層成像更為理想的熒光標記分子。

本文使用的iRFP713的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為690nm和713nm，是單體熒光蛋白分子，其發(fā)光性質較為穩(wěn)定，較長的光譜特點使其在活體動物組織成像的應用中更具潛力。 腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）是一種線性的單鏈DNA的微小病毒，分子量小，是當前zui受歡迎的基因載體之一。AAV的基因組中有三個重要的結構：ITR序列，Rep和Cap基因，ITR是AAV DNA兩端的倒置末端重復序列，是腺相關病毒載體不可或缺的順式作用元件。ITR自我互補形成倒T型結構，能維持基因組穩(wěn)定，使外源基因能夠在細胞及動物許多組織中長期穩(wěn)定有效地表達。腺相關病毒無病原性，一般不會致病，不會產(chǎn)生細胞內免疫反應和細胞毒性，對生物機體安全，是較為安全的病毒載體。 本論文通過分子克隆等手段將iRFP713基因克隆到含AAV2的ITR序列的質粒載體上構建重組真核表達載體pAAV-iRFP713。pAAV-iRFP713質粒和pDG質粒共轉染AAV-293細胞后，利用pAAV-iRFP713質粒提供AAV2病毒所必須的ITR序列，輔助質粒pDG提供AAV2重組復制、包裝病毒外殼等所必須的Rep和Cap基因，在宿主細胞內包裝攜帶iRFP713基因的重組腺相關病毒(Recombinant adeno-associated virus, rAAV ) rAAV-iRFP713。72h后收集重組病毒并分離濃縮純化，經(jīng)實時熒光定量PCR測定其拷貝數(shù)即物理滴度。 攜帶近紅外熒光蛋白基因的重組表達質粒載體和重組病毒載體體外轉染細胞后，在多種細胞中均能成功表達，細胞標記效果良好。為了檢驗iRFP713在動物組織中的表達和成像效果，將重組病毒注射小鼠骨骼肌，在兩天，一周、兩周、一個月時在近紅外熒光活體成像系統(tǒng)觀察到熒光信號，表明腺相關病毒載體能攜帶近紅外熒光蛋白長期穩(wěn)定表達。 綜合上述，iRFP713基因表達穩(wěn)定，熒光信號強，是良好的細胞標記分子。重組腺相關病毒攜帶iRFP713在小鼠骨骼肌中能長久有效穩(wěn)定的表達。此外，利用腺相關病毒的定點整合特性，我們將建立一株穩(wěn)定表達iRFP713的乳腺癌細胞株。隨著研究的進一步進行，iRFP將在動物腫瘤模型等活體動物組織成像的研究應用中表現(xiàn)更為優(yōu)越。